Surface modification of titanium substrates with nano hydroxyapatite coated chitosan microspheres

Abstract

Today, implants are increasingly used to replace or support the damaged structure or function in human body. Titanium and Ti based materials are commonly preferred as implant materials due to their superior mechanical features and biocompatibility. Although implants are biocompatible, well designed, and functional, they carry the risk of infection. Implant associated infections are serious problem after surgical operations because they generally lead to revision surgery and thus increase morbidity, length of hospitalization and health care cost. These infections are generally caused by the attachment of microorganisms to the implant surface and subsequently biofilm formation. In order to address this problem, surface modification of implant materials and drug delivery strategies have been studied. Releasing antibiotics from the implant surfaces is an effective approach to increase the implant success by local antimicrobial delivery. For further improvement, the hydroxyapatite coating is one of the most preferred methods to fasten osseointegration. In this study, Ti surfaces were modified with antibiotic loaded chitosan microspheres and coated with nano hydroxyapatite (nHA) to prevent implant related infections and increase the osseointegration. Firstly, antibiotic (ciprofloxacin) loaded chitosan microspheres were prepared via emulsion/cross-linking method using different stirring rates (300, 400 and 500 rpm) and analyzed under light and electron microscopes. It was seen that more homogenous size distribution and smaller microspheres were obtained with increasing stirring rate and 500 rpm was preferred for microsphere production. Before the immobilization of microspheres, Ti plates were oxidized and then silanized with APTES (3-Triethoxysilylpropylamine) to form amino groups (- NH2) on the surfaces. Ti plates were characterized with Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) to analyze the chemical composition of surfaces and scanning electron microscopy (SEM) to examine surface morphology. Characterization studies proved that chemical groups required for cross-linking were formed on the surfaces. After that, the chitosan solution was used for immobilization of the microspheres. Microsphere - chitosan solution (2%) was prepared and spread on Ti surfaces activated with glutaraldehyde GA (8%) for cross-linking, then the samples were freeze-dried and analyzed by SEM. The amount of chitosan solution and microspheres were optimized, and the chitosan to microsphere ratio was chosen as 50:5 (µl:mg) for 1.5 cm2 Ti plate. Secondly, microsphere – chitosan modified Ti samples were coated with nHA using CaCl2 (1.25 mM) and Na2HPO4 (0.75 mM) solutions. The presence of nHA was analyzed with FT-IR and X-ray diffraction spectroscopy (EDS), and the crystalline structure of nHA was analyzed with an X-Ray diffractometer (XRD) then nHA structures on the surfaces were viewed by SEM. Characteristic functional groups (-OH and -PO4 -3 ) of nHA were detected in FT-IR analysis and Ca and P minerals were observed in EDS analysis. Before the drug release study, the whole system was tested xx in PBS for 30 day and flaking or fractures were not observed showing the stability of the system. Finally, drug release studies were carried out with free and immobilized microspheres (uncoated and nHA coated) and it was seen that sufficient amount of drug can be released from Ti surfaces although drug release profiles were affected by immobilization and nHA coating. Thus, a dual-functional system with antibacterial activity and tissue integration ability could be made. This system will be used in animal experiments after the antibacterial and bioactivity studies.

Günümüzde teknolojideki gelişmelerle birlikte insan vücudundaki eksik veya hasarlı yapıları onarmak için yapılan implant tedavileri de artmaktadır. İnsan vücudundaki kemik ve eklemlerde işlev kaybı, zayıflama ve iltihaplanma gibi sağlık problemlerinin çok olmasından dolayı kalça, diz ve spinal protez ameliyatları en sık yapılan implant tedavileridir. Bu gibi sert doku tedavilerinde titanyum ve alaşımlarından üretilen implant malzemeleri, biyouyumlulukları ve geliştirilebilir mekanik özellikleri nedeniyle sıkça kullanılmaktadır. İmplantlar biyouyumlu, iyi tasarlanmış fonksiyonel malzemeler olsalar bile yüksek enfeksiyon riski taşımaktadırlar. İmplantla ilişkili enfeksiyonlar genellikle ameliyatların tekrarlanmasıyla tedavi edildikleri için morbidite oranını, hastanede yatış süresini ve sağlık masraflarını artırmaktadırlar. Bu nedenle implanttan kaynaklanan enfeksiyonlar, cerrahi işlemler sonrasında karşılaşılan en büyük problemlerden biridir. İmplantla ilgili enfeksiyonları önlemek ve kemik-doku etkileşimini artırmak için implant yüzeylerinin işlevselleştirilmesi ve ilaç salımı ile ilgili çalışmalar yapıldığı görülmektedir. İmplanla ilişkili enfeksiyonları önlemek için antimikrobiyal implant yüzeyleri hazırlamak en önemli yaklaşımlardan biridir. Bu yüzeyler ya mikroorganizmaların yüzeye tutunmasını engelleyecek yada yüzeyden biyosit salımı yapılarak öldürülmesini sağlayacak kaplamalarla hazırlanmaktadır. Bölgesel ajan salımı yapan sistemlerin uzun süreli kullanım için daha etkili oldukları görülmüştür. Bu nedenle dirençli mikroorganizmaların yüzeye bağlanması ve sonrasında biyofilm oluşturmasıyla oluşan bu enfeksiyonlarla mücadele etmek için, yüzeylerinden antimikrobiyal ajan salımı yapabilen sistemler üzerine araştırmalar yoğunlaşmıştır. İlaç salım sistemlerinde, mikro küre temelli sistemler özel uygulama alanları sağladığı, biyoyararlanımı artırdığı, uzun süreli terapötik etki sağladığı, kullanılan dozu ve toksik etkiyi azalttığı ve kontrollü salımı sağladığı için sıkça kullanılır. Mikroküre esaslı ilaç salım sistemlerinde, biyouyumlu, biyolojik olarak bozunabilen ve toksik olmayan kitosan, sıkça tercih edilen doğal polimerlerden biridir. Bu çalışmada da ilacın kontrollü salımı için kitosan esaslı mikro kürelerle çalışılmıştır. İmplant malzemesinin yüzey özelliklerini geliştirmek böylece implant/doku arakesitinde hızlı ve kuvvetli bağlar oluşturmak için nano hidroksiapatit (nHA) kaplamalar yaygın olarak kullanılmaktadır. Yapılan çalışmalarda, nano hidroksiapatit kaplamalarının kemik hücrelerinin çoğalmasını artırdığı, çekirdeklenme merkezi oluşturarak apatit çökelmesini hızlandırdığı ve antimikrobiyal etkisinin olduğu görülmektedir. Hücreler üzerindeki olumlu etkileri ve antimikrobiyal özellikleri nedeniyle bu çalışmada nHA kaplama kullanılmıştır. Bu çalışmanın amacı, implantla ilişkili enfeksiyonları önlemek ve osseoentegrasyonu arttırmak için titanyum yüzeylerinin değiştirilmesidir. Bu amaçla titanyum (Ti) xxii yüzeyler antibiyotik yüklü kitosan mikroküreler ile modifiye edilmiş ve nano hidroksiapatit ile kaplanmıştır. İlk olarak, antibiyotik (siprofloksasin) yüklü kitosan mikroküreler emülsiyon çapraz bağlama yöntemi kullanılarak üretilmiştir. Karıştırma hızının mikroküreler üzerindeki etkisini incelemek için farklı karıştırma hızları (300, 400 ve 500 rpm) kullanılmıştır. Üretilen kürelerin boyutları ve morfolojileri ışık ve elektron mikroskopları kullanılarak analiz edilmiştir. Karıştırma hızının artmasıyla birlikte küre boyutlarının küçüldüğü ve daha homojen bir boyut dağılımı elde edildiği görülmüştür, bu nedenle küreler 500 rpm karıştırma hızı kullanılarak üretilmiştir. Mikroküreler yüzeye tutuklanmadan önce titanyumun yüzeyler aktifleştirilmiştir. Öncelikle titanium plaka 1,5 cm2 boyutlarında kesilmiştir ve hazırlanan yüzeyler kimyasal olarak parlatılmıştır. Parlatılan titanyum altlık malzemeler, yüzeylerinde hidroksil gruplarının (-OH) oluşması amacıyla alkali işlem uygulanarak oksitlenmiştir. Sonrasında yüzeylerde çapraz bağlanma için gerekli olan amino gruplarının (-NH2) oluşması için APTES (3-Trietoksisililpropilamin) ile silanize edilmiştir. Ti altlık malzeme yüzeylerinde oluşan kimyasal grupları analiz etmek için Fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) ve yüzey morfolojisini incelemek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılmıştır. FT-IR analizinde, oksitlenen yüzeylerde - OH grupları ve silanlanan yüzeylerde -NH2 grupları tespit edilmiştir. SEM analizinde, oksitlenen yüzeylerde ağsı yapıların oluştuğu görülürken silanlandıktan sonra ağsı yapıların kaybolduğu daha yoğun bir tabaka oluştuğu görülmüştür. Yüzeylerin çapraz bağlanma için hazır olduğu görüldükten sonra, hazırlanan mikroküreler bu yüzeylere kitosanın serbest amino grupları kullanılarak immobilize edilmiştir. Bunun için, kitosan solüsyonu (%2)-mikroküre karışımı hazırlanmıştır. Daha sonra, son olarak silanlanmış olan yüzeyler gluteraldehit (GA, %8) ile aktifleştirilerek çapraz bağlanma için hazır hale getirilmiştir. Kitosan solüsyonu-mikroküre karışımı aktive edilen Ti yüzeylere ince bir tabaka halinde yayılmıştır ve hazırlanan titanyum numuneler liyofilizasyon işlemiyle kurutulmuştur. Kurutulan numuneler yüzeydeki kaplamanın incelenmesi amacıyla elektron mikroskobu ile analiz edilmiştir. Kitosan solüsyonu : mikroküre (μl:mg) oranı 100:5, 50:10 ve 50:5 oranları kullanılarak optimize edilmiştir. Mikrokürelerin yüzeyden ayrılmadığı ve kitosan filmin kırılmadığı yani kaplamanın stabil ve homojen olduğu 50:5 (μl:mg) kitosan solüsyonu : mikroküre oranı, 1,5 cm2 boyutundaki bir Ti plaka için optimum olarak belirlenmiştir ve ilerleyen çalışmalarda bu oran kullanılmıştır. İkinci olarak, kitosan film yardımıyla mikroküre immobilize edilen Ti yüzeyler çöktürme yöntemi kullanılarak nano hidroksiapatit (nHA) ile kaplanmıştır. Bunun için kitosana ait amino gruplarıyla koordine kovalent bağa ile ve ayrıca hidroksil gruplarıyla elektrostatik etkileşime dayanan çöktürme işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla öncelikle CaCl2 (1.25 mM) kalsiyum kaynağı olarak kullanılmıştır. Kalsiyumun yüzeyde birikmeye başlamasından sonra, Na2HPO4 (0.75 mM) solüsyonu fosfat kaynağı olarak kullanılarak nHA çökelmesi gerçekleştirilmiştir. Yüzeylerdeki nHA varlığı FT-IR ve X-ışını kırınım spektroskopisi (EDS) ile analiz edilmiştir. Kristal yapısı X ışını kristalografisi (XRD) ile analiz edilmiştir ve morfolojik yapısı SEM ile görüntülenmiştir. FT-IR analizinde, nHA yapısına ait karakteristik fonksiyonel gruplar (-OH ve -PO4 -3 ) ve EDS analizinde, Ca ve P minerallerinin varlığı gözlemlenmiştir. İlaç salım çalışmasından önce, mikroküre immobilize edilen ve nHA ile kaplanan Ti yüzeyler 30 gün boyunca PBS içinde bekletilerek test edilmiştir ve yüzeylerde bozulma veya mikrokürelerin kopması gibi olumsuzluklar gözlemlenmemiştir. Sistemin stabil olduğunun tespit edilmesinden sonra, ilaç salım çalışmaları serbest ve immobilize edilmiş mikroküreler (kaplanmamış ve nHA kaplanmış) ile gerçekleştirilmiştir. İmmobilizasyon işleminin ve nHA xxiii kaplamanın ilaç salım hızını yavaşlattığı gözlemlenmiştir. Buna rağmen tüm yüzeylerden sürekli ve yeterli ilaç salımı yapılabildiği görülmüştür. Böylece antimikrobiyal etki ve hızlı osteoentegrasyon yeteneği gibi iki fonksiyonalitesi olan sistem yapılabilmiştir. Bu sistem, antimikrobiyal aktivite ve biyoaktivite testlerinden sonra hayvan deneylerine uygulanabilecektir.