Recombinant expression, purification and characterization of TNFR1

Abstract

Receptor/ligand interactions are the mechanisms that form the basis of many signaling pathways. Establishing the correct interaction is crucial for ensuring regulation at the cell level and for the cell's proper functioning. Cytokines are low-molecular-weight glycoproteins that are secreted by different cells in the body, mainly cells of the immune system and which coordinate and propagate immune responses within the body. They have specific effects on the interactions and communications between cells. Cytokines can be divided into pro-inflammatory (such as tumor necrosis factor-alpha (TNFα), interleukin-6) or anti-inflammatory (interleukin-10). The cytokine TNF-α is expressed by a great variety of cells and forms homo-trimers in circulation that have wide biological effects. It is known that TNF-α has important effects, especially in autoimmune diseases. TNF-α acts by binding to specific receptors on the cell surface, stimulating secondary signal pathways. As a result of the stimulation, the signal cascade continues in three main ways: two of them are effective in the inflammation related to nuclear factor (NF) and the third is effective in the process of apoptosis. Today, the use of TNF-α receptors as inhibitors in the treatment of diseases that develop due to the increase of TNF-α is one of the approaches used in the clinical field. TNF-α has two forms in the body, the first of which is the membrane-anchored form (26 kDa), while the second is the secreted form (17 kDa). Firstly, TNF-α is synthesized as a trimeric molecule in which each subunit is corded to the cell surface through a membrane anchor. These membrane tethers are cut by the TNF-α converting enzyme (TACE / ADAM17) which is major sheddase. TNF-α achieves all its different cellular effects by its binding to either the TNF-α receptor 1 and 2 (TNFR1 and TNFR2). TNFR1 and TNFR2 are transmembrane I type proteins located on the cell surface. TNFR1 can interact with both soluble and membrane-bound forms of TNF-α, while TNFR2 can only be stimulated by membrane-bound TNF-α. TNFR1 consists of three main domains: extracellular, transmembrane, and intracellular domain. Signaling proceeds by the recognition of TNF-α trimers by endogenic TNF receptors (TNFR) 1 and 2, which form trimers themselves before complex formation with TNF-α. The intracellular downstream signal pathway begins as a result of conformational changes occurring in the intracellular domain by the interaction of TNF-α in the trimer structure with the extracellular domain of TNFR1. It has been proven that anti-inflammatory antibodies and antigen-binding fragments (Fab) against TNF-a successfully suppress TNF-a induced inflammation in inflammatory autoimmune diseases. In the field of biotherapeutic medicine, there are approaches regarding the use of TNFR1's extracellular domain as a therapeutic tool. In light of these approaches, we aimed at bacterial production, purification, and characterization of the extracellular domain of TNFR1 (hereafter TNFR1). In our study, the plasmid containing the TNFR1 gene was transferred into the host cell of which is Escherichia coli (E. coli) BL21DE3. Protein expression was achieved by IPTG induction. Inclusion bodies formed in the cell as a result of high protein expression were isolated from cell lysates and solubilized. The target protein was purified from the protein mixture by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Purification efficiency was confirmed by sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting techniques. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) was used to understand the native structure of the pure protein and it was found that the protein was in dimer structure. In order to secondary structure estimation of the purified protein, circular dichroism (CD) which is defined as the unequal absorption of left-handed and right-handed circularly polarized light was used. According to measurements in the far-UV range, beta structures were found to be dominant in the protein structure. In the measure of protein purity, capillary electrophoresis (CE-SDS) and high-performance liquid size exclusion chromatography (HPLC-SEC) methods, which are more sensitive techniques for protein characterization, were used. The purified protein was determined to be> 95% purity by CE-SDS. It was confirmed that the protein in the HPLC-SEC was dimeric according to the molecular weight and size of the pure protein. A Pull-down assay was utilized for the determination of the functionality of the recombinant protein. Binding experiments were performed with both the receptor in the cell lysate and the purified ones. As a result of the pull-down assay, the receptor was found to bind to TNF-α. The sample of the binding assay with purified receptor was also analyzed by the HPLC-SEC method and complex formation was observed. Based on the result of the experimental findings, it was found that the methods developed for the engendering and purification of the recombinant TNFR1 protein can be used to obtain the pristine product that maintains its bioactivity.

Reseptör/ligand etkileşimleri bir çok hücre içi sinyal yolağının temelini oluşturan mekanizmalardır. Bu etkileşimler hücre içi sinyal iletiminin başlamasına sebep olarak hayati fonksiyonların gerçekleşmesini sağlar. Bu nedenle, doğru etkileşimin kurulması, hücre düzeyinde regülasyonun sağlanması ve doğru işleyiş için büyük önem arz etmektedir. Sitokinler, vücutta bir çok hücre tarafından üretilen ve önemli sinyal yolaklarında görev alan bir protein grubudur. Özellikle immün sistemin regülasyonunda ve inflamatuar olaylarda kilit rol oynarlar.Tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) da geniş biyolojik etkilere sahip ve glikoprotein yapısında bulunan bir sitokindir. Sitokinler, hücreler arası iletişimi sağlayan ve hemen hemen tüm biyolojik proseslerde rol oynayan haberci moleküller olmaları nedeniyle günümüzde çeşitli hastalıkların tedavisi için biyolojik cevabı modifiye edici olarak kullanılmaktadır. TNF-α'nın da özellikle otoimmün hastalıklarda önemli etkilere sahip olduğu bilinmektedir. TNF-α hücre yüzeyinde bulunan özgül reseptörlere bağlanarak ikincil sinyal yolaklarını uyarır. TNF-α ile uyarılmış bir hücrede sinyal kaskatı üç ana yoldan devam eder: bunlardan ikisi nükleer faktör (NF) ile inflamasyon sürecinde üçüncü yol ise apoptoz sürecinde etkilidir. Günümüzde, TNF-α'nın artışına bağlı olarak gelişen hastalıkların tedavisinde TNF-α reseptörlerinin inhibitor olarak kullanılması klinik alanda kullanılan başarılı yaklaşımlardan biridir. TNF-α vücutta iki formda bulunabilen, transmembran II tipi bir proteindir. Bunlardan ilki 26 kDA'lık membrana bağlı formu iken ikincisi TNF-α dönüştürücü enzim (TACE/ADAM17) tarafından proteolitik olarak kesilerek oluşturulan 17 kDa'lık çözünür formudur. Monomer olarak üretilen TNF-α, homotrimer yapılarını oluşturarak bir sinyal yolağını başlatabilecek forma dönüşür. TNF-α'nın biyolojik etkinliği spesifik reseptörleriyle etkileşimi sonucu ortaya çıkar. Tümör nekroz faktör reseptörü 1 ve 2 (TNFR1 ve TNFR2) hücre yüzeyinde bulunan transmembran I tipi proteinlerdir. TNFR1, TNF-α'nın hem çözünür hem de membrana bağlı formları ile etkileşebilirken TNFR2 yalnızca membrana bağlı TNF-α tarafından uyarılabilir. TNFR1 proteinini oluşturan üç ana domain vardır: ekstraselüler, transmembran ve intraselüler domain. 17 kDA'lık monomerlerinin bir araya gelmesiyle oluşan homotrimer yapıdaki TNF-α'nın, TNFR1'in ekstraselüler domaini ile etkileşimiyle intraselüler domainde konformasyonel değişiklikler meydana gelir ve hücre içi alt sinyal yolağı başlamış olur. Günümüzde TNF- α artışına bağlı gelişen hastalıkların tedavisinde kullanılan birçok inhibitör ilaç mevcuttur. Bunlardan üç tanesi monoklonal antikor yapısındaki infliksimab, adalimumab ve golimumabdır. Füzyon proteini olan etanercept ve insanlaştırılmış antikor fragmanı olan sertolizumab ise diğer biyoteknolojik ilaçlardır. Özellikle ankilozan spondilit ve romatoid artrit gibi otoimmün hastalıklarda bu inhibitörlerden büyük ölçüde faydalanılmıştır. Biyoterapotik ilaç alanında, TNFR1'in ekstraselüler domainin de terapotik bir araç olarak kullanılmasına ilişkin yaklaşımlar bulunmaktadır. Biz bu çalışmada, TNFR1'in ekstraselüler domainin bakteriyel olarak üretimini, saflaştırılmasını ve karakterize edilmesini amaçladık. Çalışmamızda Escherichia coli (E. coli) konak hücre olarak kullanıldı ve TNFR1 genini içeren plazmit, konak hücreye transfer edildi. Protein ekspresyonu IPTG indüklemesi ile sağlandı. Protein ekspresyonu sonucu hücre içinde meydana gelen inklüzyon cisimcikleri izole edilip çözünür hale getirildi. Ardından polihistidin etiketine sahip proteini saflaştırmak için immobilize metal afinite kromatografisi kullanıldı. Saflaştırma kalitesi sodyum dodesil sülfat jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve immünoblotlama teknikleri ile kontrol edildi. Proteinlerin nativ haldeki kütlelerinin ve oligomerik durumlarının belirlenmesi protein analizinde kritik öneme sahiptir. Saf TNFR1 proteinin nativ yapısının anlaşılması için mavi doğal poliakrilamit jel elektroforezi (BN-PAGE) kullanıldı ve proteinin dimer yapıda bulunduğu anlaşıldı. Üst ve alt akım işlemlerinin sonunda elde edilen proteinin fonksiyonel olabilmesi için sahip olduğu ikincil yapıyı koruması gerekmektedir. Beer-Lambert's kuralı temel alınarak optikçe aktif yapıların ikincil yapısı belirlenebilmektedir. İkincil yapıda bulunan α-heliks, β-sheet gibi yapıların belirlenmesi hem protein yapısının anlaşılmasında hem de farklı proteinlerin yapısal olarak karşılaştırılmasında kullanılmaktadır. Temel olarak α-heliks yapısındaki bir protein 208 ve 222 nm dalgaboylarında iki negatif pik, 190 nm dalgaboyunda pozitif pik vermektedir. β-sheet yapısındaki proteinler ise 196 nm dalgaboyunda pozitif, 218 nm dalgaboyunda negatif pik vermektedir. Bu çalışmada, saflaştırılmış proteinin ikincil yapı karakterizasyonu için sirküler dikrozim (CD) ile far-UV (<260 nm) aralığında ölçüm yapıldı ve protein yapısında beta yapılarının dominant olduğu görüldü. Saflaştırılmış proteinin karekterizasyonu için kullanılan diğer yöntemler ise kapiler elektroforezi (CE-SDS) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi-boyut dışlama (HPLC-SEC) teknikleridir. CE-SDS tekniği, SDS-PAGE tekniğinin daha modern ve hassas versiyonu olmakla birlikte proteinlerin yüksek voltaj altında kılcal bir boru içerisinde ayrılmasını sağlar. Bu sayede protein karışımı içerisindeki safsızlıklar belirlenebilmektedir. CE-SDS ile yapılan analiz sonucunda saflaştırılmış proteinin >95% saflıkta olduğu tespit edildi. Çözünmüş molekülleri boyutlarına göre ayırmak için kullanılan HPLC-SEC ile yapılan analizle de proteinin dimer yapısında olduğu teyit edildi. Üretilen rekombinant proteinin fonksiyonel tayini için aşağı çekme deneyi (pull-down assay) kullanıldı. Pull-down assay için reseptörün polihistidin etiketi kullanılarak nikel bağlı agaroz rezinine bağlanması sağlanmıştır. Ardından ligand olan TNF-α agaroz rezine bağlı reseptörün üzerine eklenerek etkileşmesi için inkübe edilmiştir. Hem hücre lizatı içerisinde bulunan reseptör hem de saflaştırılmış olan reseptör ile gerçekleştirilen bağlanma deneylerinin sonucunda reseptörün her iki durumda da TNF-α'ya bağlandığı görüldü. Hücre lizatı ile yapılan bağlanma deneyi öncelikle SDS-PAGE metoduyla konrol edildi. Ardından TNF-α'ya ait olduğu tahmin edilen protein bandı jelden kesilerek peptid haritalama metoduyla sıvı kromatografisi-kütle spekrometresi (LC-MS) cihazıyla analiz edildi. Analiz sonucu kesilen bandın TNF-α'ya ait olduğu dolayısıyla da bağlanma deneyinin başarılı olduğu görüldü. Saflaştırılmış reseptör ile yapılan bağlanma deneyine ait örnek SDS-PAGE'in yanı sıra HPLC-SEC yöntemi ile de analiz edildi ve kompleks oluşumu gözlendi. Elde edilen sonuçlar üretilen proteinin saflaştırma öncesi ve sonrasında fonksiyonlarını koruduğunu göstermiştir. Deneysel bulguların sonucunda, rekombinant TNFR1 proteinin bakteriyel üretiminin başarılı olduğu ve polihistidin etiketine sahip proteinin saflaştırılması için geliştirilen metodun uygun olduğu görülmüştür. Yapılan temel ve ileri düzey analiz teknikleri ile saflaştırılmış proteinin biyolojik aktivitesini koruduğu belirlenmiştir.