Controlled release of tetracycline hydrochloride from copolymer/gelatin nanofibers

Abstract

Use of nanofibers in biomedical applications have been rising significantly in recent years. Drug delivery systems are developed in order to enable the drug to perform with maximum therapeutically efficiency by preventing the degradation before the targeted spot and ensuring the protection of activation. Besides, drug delivery systems protect the body from the adverse effects of the active pharmaceutical ingredient. Conventionally, drug is given to the body by different methods such as injection, oral, implantation etc. When drug is used by these methods, it effects both the healthy and unhealthy organs. Also, conventional drug formulations cause quick release and quick removal from the body. Therefore, in most cases multiple dose is needed for healing. Multiple dose increases the toxic effects and may result in the occurrence of side effects. Recently, the importance of developing drug delivery systems with controlled release and controlled targeted spot release have risen significantly. Studies prove the success of polymeric drug delivery systems in controlled release. Electrospinning is the most frequently used method to obtain nanofiber. In this method, natural or synthetic polymer solutions are spinned under electric force in order to achieve nanofibers from 2nm up to a few micro-meters. Nanofibers presents great advantages for drug delivery systems due to their special properties such as high surface-volume ratio, pore structure, high permeability, easy penetrability and biocompatibility achieved by using natural polymers. Aliphatic polyesters synthesized with enzymatic ring opening polymerization do not generate a toxicity risk because of the method of synthesis without a catalyst and can be used in drug delivery systems. Enzymatically synthesized poly(ω-pentadecalactone-co-ɛ-caprolactone) has been chosen as the polymer in this study because of its biocompatibility, biodegradability and good mechanical strength properties. Due to the improvement of mechanical and degradation properties and hydrophobic structure, prevention of uncontrolled water release was expected from nanofibers synthesized from poly (ω-pentadecalactone-co-ε-caprolactone) copolymers by immobilizing lipase enzyme on rice husk ashes as the method found in literature. Besides, gelatin which is a natural polymer was used in order to achieve easier acceptance of drug release system by the body and increase the compatibility with human cell. Nanofiber membranes obtained with a lab scale electrospinning machine from various copolymer/gelatin concentrations and volume-wise several double mixture compositions were studied in two different solvent systems as the first step of the study. Chloroform and methanol (3:1 v, v) for copolymer, acetic acid and formic acid (1:1 v, v) for gelatin were chosen as the first solvent system. 15% and 30% by weight for copolymer and 8% and 15% by weight for gelatin were prepared in solution. Afterwards, obtained solutions were mixed with various volume ratios. The achieved mixtures were electrospinned using syringe for transfer. Phase separation was observed when the mixture was leaving the syringe during electrospinning process. Nanofibers obtained from the first solvent system were viewed by scanning electron microscope (SEM). Beaded and defected structure was observed on the membrane because of the phase separation. Increasing copolymer concentration in double mixtures resulted in increased beaded structure with a few nanofibers in between. Besides, an increase from %8 to 15% in weight of gelatin concentration increased the defects as well. A new solvent system has been researched in order to prevent the defects in the structure. As a result of this research, hexafluoroisopropanol; a solvent which can dissolve both the copolymer and gelatin, was chosen for the second solvent system. 15% copolymer and 8% gelatin solutions by weight were prepared and mixed with varios volume ratios (100:0, 70:30, 60:40, 50:50). As a result of SEM images, electrospinning of 50:50 volume ratio mixture of 15% copolymer and 8% gelatin solutions had the best fiber structure and the best fiber diameter distribution (average fiber diameter: 305.0±45.5nm). Membranes obtained with this ratio were used on the next steps of the study because of it having the most effective and the most proper structure. In order to increase the mechanical properties and the stability of the membranes, they were crosslinked for 2 and 24 hours in glutaraldehyde vapour. Then, in vitro degradation properties were examined in pH 7.4 phosphate buffer solution. 2 hours crosslinked membrane preserved its structure in phosphate buffer solution after 30 days. Degradation tests proved that 2 hours crosslinked membrane had high hydrolytic resistance against buffer solution. Even though 24 hours crosslinked membrane had better mechanical resistance, 2 hours crosslinked membranes were chosen because of the higher toxicity of 24 hour crosslinked membrane due to higher glutaraldehyde ratio. 2 hours crosslinked membrane was placed to shaking bath in buffer solution and mass loss was calculation in various time intervals (1, 3, 5, 7, 14, 21, 30 days). Membrane has lost the 20% of its initial mass after 10 days. Copolymer/gelatin nanofiber, 2 hours crosslinked copolymer/gelatin nanofiber and copolymer have been analysed by fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), thermal gravimetric analysis (TGA), differential scanning calorimetry (DSC) and contact angle measurement. As a result of contact angle measurement 2 hours crosslinked membrane was found suitable because it preserved its hydrophillic properties and improved its hydrolytic properties compared to non-crosslinked membrane. An increase in thermal resistance properties of the membrane was observed according to TGA results. As the second step of the study, calculated amount of Tetracycline Hydrochloride antibiotic was dissolved in HFIP. The amount of drug was arranged as 0.5%, 1%, 3% and 5% of the total polymer/gelatin concentration by weight. Drug loaded nanofiber membranes were obtained by electrospinning the mixture with 2ml/hour flow rate and under 25kV room temperature conditions. Afterwards, membrane was crosslinked for 2 hours in 25% glutaraldehyde solution vapour. Crosslinked nanofibers were dried for 2 hours in 80°C in order to remove remaining glutaraldehyde. After the crosslinking process, drug loaded copolymer/gelatin nanofiber membranes were cut in to 2 x 2 cm2 pieces and weighed. 3 samples were prepared as described for each drug loading ratio and these samples were sunk in 10 ml pH 7.4 phosphate buffer saline (PBS). Later on, samples were placed in 37°C shaking bath(120rpm). 1ml parts were taken of and changed with fresh PBS in determined time intervals. Removed mixtures were characterized by using UV spectrophotometer in 343nm. Amount of drug released was calculated by using calibration graph. Later on, cumulative drug release amount was reached. Initial drug amount in the membrane was calculated according to the drug ratio in polymer blend and the weight of the drug loaded membrane. SEM images of drug loaded nanofibers proved that, randomly aligned, even and beadless antibiotic loaded samples for each ratio were obtained. Fiber diameters showed normal distribution generally. A tendency in the decrease of diameter was observed after drug loading. Highest average nanofiber diameter (282.9 ± 64.6 nm) was measured in the lowest drug loading ratio (0.5% by weight). Other drug loading ratios ( 1%, 3% and 5% by weight) caused the formation of significantly thinner nanofibers (180-200 nm) (p <0.001). On the other hand, there was no meaningful diameter difference between 3 drug loaded samples (p> 0.05). EDS spectrum of 0.5% by weight drug loaded and crosslinked membrane was obtained in order to determine the presence of tetracycline hydrochloride in drug loaded copolymer/gelatin nanofiber structure. Cl spectrum has verified the presence of tetracycline hydrochloride because Chloride (Cl) is made up of the molecular structure of tetracycline hydrochloride. Additionally, nitrogen (N) and sulphur (S) peaks were detected in EDS spectrum. These peaks proved the presence of gelatin in nanofibers. Cumulative drug release graph showed that, instant release and 14th day release for each drug load were similar to each other. For each drug load ratio, instant release in 1 hour was less than 11%. On the other hand, 0.5% by weight drug loaded sample displayed relatively low instant release percentage (% 9.1 ± 0.1) and highest (p <0.001 or p <0.05) total drug release percentage (% 69.4 ± 0.2). 0.5% ratio drug having low instant release and highest gradual total drug release was determined as the most efficient antibiotic ratio for copolymer/gelatin ratio developed at this stage of the study. As the next stage of the study, antibacterial tests of the antibiotic loaded nanofibers were performed by using disk diffusion method; which is the measurement of the bacterial growth inhibition zones for the determination of antibacterial activity. Antibacterial activities were tested against Gram positive (S. aureus and B. subtilis) and Gram negative (E. coli) bacteria. Results showed that all samples with various loading ratios presented open inhibition zones against Gram positive bacteria (S. aureus and B. subtilis). Bigger inhibition zones were monitored in petri dishes with B. subtilis (~ 30-40 mm). This result proved that drug loaded membranes were extremely active and effective against B. subtilis. Meanwhile, samples showed limited activity against E. coli. No inhibition zone was detected for 0.5% by weight tetracycline hydrochloride and samples with higher concentrations showed very low antibacterial activity (~ 8-10 mm inhibition zone). It was found that; parallel with the literature, Gram negative bacteria E. coli was much more resistant to tetracycline hydrochloride antibiotic. Additionally; as expected, inhibition zones expanded as the antibiotic concentration increased. Optimal antibiotic ratio; obtained by release properties, was determined as 0.5%. 0.5% antibiotic ratio had enough efficacy for gram positive bacteria, however for broad spectrum antibiotic, antibiotic loading ratio has to be increased. In this study, increase of the mechanical properties by using enzymatically synthesized copolymer and increase of cell compatibility by using a natural polymer gelatin while obtaining nanofiber with electrospinning process were targeted. Nanofiber membrane with the optimal structure was successfully achieved by trying various copolymer/gelatin ratios and different solvents. Crosslinked samples were characterized without drug loading in order to increase the mechanical properties and degradation properties were examined. At the final step of the study, controlled release properties of antibiotic loaded membranes with various ratios has been examined and their activity against bacteria was measured.

Son yıllarda biyomedikal uygulamalarda nanoliflerin kullanılmasına olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. İlaç taşınım sistemleri, ilaçların maksimum iyileştirme özelliği gösterebilmesi için hedeflenen bölgeden önce bozunmasını engellemek ve aktivasyonunun korumasını sağlamak için geliştirilmektedir. Ayrıca ilaç taşıma sistemleri vücudu ilaç etken maddesinin olumsuz etkilerinden korur. İlaç taşıma sistemleri, ilacın etkinliğini arttıran polimer veya lipid taşıyıcı sistemlerdir. Bu sistemlerde, ilacın salım süresini ve hızını geliştirerek, ilacın hedef bölgeye ulaşması sağlanır. Geleneksel olarak ilaç vücuda enjeksiyon, oral sindirim, implantasyon gibi yöntemlerle verilir. İlaç bu yöntemlerle vücuda alındığında hem sağlıklı hem de sağlıksız organ ve hücreleri etkiler. Ayrıca geleneksel ilaç formülasyonları hızlı salıma neden olur ve ilaç vücuttan hızlı bir şekilde atılır. Bu nedenle iyileşme için çoğu zaman çoklu dozlama gerekir. Bu da toksik etkileri arttırır ve ilacın yan etkilerinin ortaya çıkmasına neden olabilir. Son yıllarda kontrollü salım sağlayan ve hedeflenen bölgede ilacın salımını kontrol edebilen ilaç taşıma sistemleri geliştirmek oldukça önem kazanmıştır. Yapılan çalışmalar, polimerik ilaç taşınım sistemlerinin kontrollü salımda başarısını göstermektedir. İlaç etken maddenin polimer matrisine hapsedilebilmesi için birçok yöntem bulunmaktadır. Bu yöntemlerden bazıları polimerden film eldesi, emülsiyon tekniği, sprey kurutma yöntemi, polimer jeller ve elektro-eğirme yöntemidir. Elektro-eğirme yöntemi nanolif elde etmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntemde 2nm ile birkaç mikrometre arasında çaplara sahip nanolifler elde etmek için, elektrik kuvveti altında doğal ve/veya sentetik polimer çözeltileri eğrilir. Nanolifler ilaç taşınım sistemleri için, yüksek yüzey-hacim oranı, gözenekli yapı, yüksek geçirgenlik, kolay işlenebilirlik ve doğal polimer çözeltileri de kullanarak elde edilebilen biyouyumluluk gibi özellikler sayesinde üstün avantajlar sunar. Ayrıca nanolif yapısı vücutta bölgeye özgü taşınımı mümkün kılan ekstraselüler matriksi taklit eder. Nanolif yapıdaki taşınım sistemlerinin bir diğer avantajı ise birden fazla ilaç aynı lifli taşıyıcıya kapsüllenebilir. İlaç taşınım sistemlerinde yaygın olarak poli (vinil alkol), poli (etilen oksit), poli (ε-kaprolakton), kitosan, jelatin gibi doğal ve sentetik polimerler kullanılabilir. İlaç salım mekanizması polimer özelliklerine ve ilaç-polimer etkileşimine göre değişir. Enzimatik halka açılma polimerizasyonu ile sentezlenen alifatik poliesterler kimyasal katalizör kullanılmadan sentezlendiğinden, toksitite riski oluşturmaz ve ilaç taşınım sistemlerinde kullanılabilir. Bu çalışmada biyouyumluluk, biyobozunurluk, iyi mekanik dayanım özelliklerinden dolayı, enzimatik olarak sentezlenmiş poli (ω-pentadekalakton-ko-ɛ-kaprolakton) seçildi. Daha önce literatürde bulunan yöntemle başarı ile pirinç kabuğu külleri üzerine immobilize edilmiş lipaz enzimi yoluyla sentezlenen poli (ω-pentadekalakton-ko-ε-kaprolakton) kopolimerinden, nanoliflerin mekanik ve bozunma özelliklerini geliştirmesi ve hidrofobik yapısının sonucu olarak kontrolsüz su salınımını engellemesi beklendi. Ayrıca ilaç salım sisteminin vücut tarafından kolayca kabul edilmesine yardımcı olması, hücre ile uyumluluğunu arttırması ve ilacın bölgeye özgü taşınmasını geliştirmesi için doğal bir polimer olan jelatin kullanıldı. Çalışmanın ilk aşamasında, 2 farklı çözücü sisteminde çeşitli kopolimer/jelatin konsantrasyonları ve hacimce çeşitli ikili karışım kompozisyonları çalışılarak, laboratuvar ölçekli bir elektro-eğirme cihazı ile nanolif membranlar elde edildi. İlk çözücü sistemi olarak kopolimer için Kloroform ve Metanol (3:1 v, v), jelatin için Asetik Asit ve Formik Asit (1:1 v, v) çözücüleri seçilmiştir. Kopolimer için ağırlıkça %15, %30, jelatin için ağırlıkça %8, %15 çözeltileri hazırlandı. Daha sonra elde edilen çözeltiler çeşitli hacim oranlarında karıştırıldı. Elde edilen karışımlar şırıngaya aktarılarak elektro-eğirme işlemine tabi tutuldu. Elektro-eğirme işlemi sırasında şırıngada çözeltinin faz ayrımına uğradığı gözlemlendi. İlk çözücü sisteminden elde edilen nanolifler taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ile görüntülendi. Faz ayrımı nedeniyle membranda boncuklu ve kusurlu yapı gözlemlendi. İkili karışımlarda artan kopolimer konsantrasyonu, aralarında birkaç nanolif bulunan çok daha fazla boncuk oluşumu ile sonuçlandı. Ayrıca, jelatin konsantrasyonunda ağırlıkça%8'den %15'e kadar artış kusurları arttırdı. Yapıdaki hataların önüne geçmek için ikinci bir çözücü sistemi araştırıldı. İkinci çözücü sistemi için hem kopolimeri hem de jelatini çözebilen Heksafluoroizopropanol çözücüsü seçildi. Ağırlıkça %15'lik kopolimer ve %8'lik jelatin çözeltileri hazırlanarak hacimce çeşitli oranlarda (100:0, 70:30, 60:40, 50:50) karıştırıldı. SEM görüntülerinden elde edilen bilgiye göre, en düzgün lif yapısına ve en iyi lif çapı dağılımına %15 kopolimer, %8 jelatin çözeltilerinin hacimce 50:50 karıştırılması ve elektro-eğrilmesi ile ulaşıldı (ortalama lif çapı: 305.0±45.5nm). Çalışmanın diğer basamaklarına en düzgün ve etkili yapıya sahip, bu orandaki karışımdan elde edilen membranlar ile devam edildi. Membranların mekanik özelliklerini geliştirmek ve kararlılığını arttırmak için Gluteraldehit buharında 2 ve 24 saatlik çapraz bağlama çalışmaları yapıldı. Daha sonra pH 7,4 fosfat tampon çözeltisi içinde, in vitro bozunma özellikleri incelendi. 2 saat çapraz bağlanmış membran Fosfat tampon çözelti içinde 30 günün sonunda yapısını korudu. Degradasyon testleri, 2 saatlik çapraz bağlı membranın tampon çözeltiye karşı yüksek hidrolitik dirence sahip olduğunu gösterdi. 24 saatlik çapraz bağlama prosesi daha iyi mekanik dayanım gösterse de, yüksek gluteraldehit oranı membranların toksititesinin artmasına neden olacağından 2 saatlik çapraz bağlama yeterli görüldü ve çalışmalara bu membran ile devam edildi. 2 saat çapraz bağlı membran tampon çözelti içinde çalkalama suyu banyosuna yerleştirildi ve kütle kaybı belirli zaman aralıklarında (1, 3, 5, 7, 14, 21, 30. gün) hesaplandı. Membran 10 gün sonunda başlangıç kütlesinin %20'sini kaybetti. Kopolimer/jelatin nanolif, 2 saat çapraz bağlanmış kopolimer/jelatin nanolif ve kopolimer, fourier dönüşümlü kızılötesi spektroskopisi (FTIR), termal gravimetrik analiz (TGA), diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) ve temas açısı ölçümü ile karakterize edildi. Temas açısı ölçümü sonucu 2 saat çapraz bağlanmış membranın ilaç salım için uygun olan hidrofilik özelliğini koruduğunu, aynı zamanda çapraz bağlı olmayan membrana göre hidrolitik direncinin geliştiğini göstermektedir. DSC sonuçlarına göre karışımda jelatinin bulunması Erime Sıcaklığını (Tm) ve Camsı Geçiş Sıcaklığını (Tg) düşürdüğünü, membranın çapraz bağlanmasının ise Tm ve Tg'yi arttırdığını göstermektedir. TGA sonuçlarına göre çapraz bağlanma sonucunda, membranın termal dayanım özelliklerinin geliştiği gözlemlendi. Çalışmanın ikinci aşamasında hesaplanan miktarda Tetrasiklin Hidroklorür antibiyotiği, HFIP içerisinde çözündürüldü. İlaç miktarı, toplam polimer/jelatin konsantrasyonunun ağırlıkça % 0.5, 1, 3 ve %5'i olacak şekilde düzenlendi. Çözelti 2ml/saat akış hızında, 25 kV altında çevre koşullarında elektro-eğirme işlemine tabi tutularak ilaç yüklenmiş nanolif membranlar elde edildi. Çapraz bağlama prosesinden önce membran yapısında kalmış olabilecek çözücüyü uzaklaştırmak için membran 24 saat boyunca 30ºC'de kurutuldu (0.1 mm kalınlık). Daha sonra membran 2 saat %25'lik gluteraldehit çözeltisi buharında çapraz bağlandı. Çapraz bağlı nanolifler, artık Glutaraldehit'den kurtulmak için 80 °C'de 2 saat kurutuldu. Çapraz bağlamadan sonra, ilaç yüklü kopolimer / jelatin naolif membranlar 2 x 2 cm2 boyutunda kesildi ve tartıldı. Her ilaç yükleme oranı için, tarif edildiği gibi 3 numune hazırlanıp ve 10 ml pH 7.4 fosfat tamponlu Salin (PBS) içine batırıldı. Daha sonra, numuneler 37°C'de çalkalamalı su banyosuna (120rpm) konuldu. Belirlenen zaman periyotlarında, 1 ml'lik kısımlar çıkarıldı ve taze PBS ile değiştirildi. Çıkarılan çözeltiler, 343 nm'de UV spektrofotometre kullanılarak karakterize edildi. Serbest bırakılan ilacın miktarı kalibrasyon grafiği kullanılarak hesaplandı. Daha sonra, kümülatif ilaç salım miktarına ulaşıldı. Membranda mevcut olan ilk ilaç miktarı, polimer harmanındaki ilaç yüzdesine ve ilaç yüklü membranın ağırlığına göre hesaplandı. İlaç yüklü nanoliflerin SEM görüntüleri gösterdi ki, Her oranda antibiyotik yüklü örneklerde rastgele hizalanmış, pürüzsüz ve boncuksuz nanolifler elde edildi. Lif çapları genel olarak normal dağılım gösterdi. İlaç yüklendikten sonra çapta azalma eğilimi gözlemlendi. En düşük ilaç yükleme oranında (ağırlıkça %0,5), en yüksek ortalama nanofiber çapı (282.9 ± 64.6 nm) ölçüldü. Diğer ilaç yükleme oranları (ağırlıkça %1, 3 ve %5), önemli ölçüde daha ince nanoliflerin (180-200 nm) oluşmasına yol açtı (p <0.001). Diğer yandan, ilaç yüklü bu 3 örnek arasında anlamlı bir çap farkı yoktu (p> 0.05). İlaç yüklü kopolimer/jelatin nanoliflerin yapısında tetrasiklin hidroklorürün varlığını saptamak için ağırlıkça %0.5 ilaç yüklü ve çapraz bağlı membranın EDS spektrumu elde edildi. Klorür (Cl) tetrasiklin hidroklorürün moleküler yapısından oluştuğu için, Cl spektrumu, tetrasiklin hidroklorür varlığını teyit etti. Ek olarak, EDS spektrumunda Azot (N) ve Kükürt (S) pikleri de tespit edildi ve bu da nanoliflerde jelatin varlığını kanıtladı. Kümülatif ilaç salım grafiği gösterdi ki, her orandaki ilaç yüklemesi için ani salım ve ardından 14. güne kadar kademeli salım birbirine benzerdi. 1 saat içindeki ani salım, tüm ilaç oranları için %11'den azdı. Diğer yandan, ağırlıkça %0,5 ilaç yüklü örnek, nispeten düşük ani salım yüzdesi (% 9.1 ± 0.1) ile en yüksek (p <0.001 veya p <0.05) toplam ilaç salım yüzdesini (% 69.4 ± 0.2) sergiledi. Çalışmanın bu aşamasında geliştirilen kopolimer/jelatin membran için en verimli antibiyotik oranı olarak, düşük ani salım ve kademeli olarak en yüksek toplam ilaç salımına sahip olan %0,5 oranındaki ilaç olduğu saptandı. Çalışmanın bir sonraki aşamasında, antibiyotik yüklü nanoliflerin antibakteriyel aktivite testleri, bakteriyel büyüme inhibisyon bölgesinin ölçülmesiyle antibakteriyel aktivitenin belirlendiği, disk difüzyon yöntemi kullanılarak yapıldı. Antibakteriyel aktiviteler Gram pozitif (S. aureus ve B. subtilis) ve Gram negatif (E. coli) bakterilere karşı test edildi. Sonuçlar, değişik antibiyotik yükleme oranlarına sahip tüm numunelerin Gram pozitif bakteri S. aureus ve B. subtilis'e karşı açık inhibisyon bölgeleri sergilediğini gösterdi. B. subtilis petri kaplarında daha büyük inhibisyon bölgeleri (~ 30-40 mm) gözlendi. Bu sonuç, ilaç yüklü membranların bu bakteriye karşı son derece aktif olduğunu gösterdi. Öte yandan, numuneler E. coli'ye karşı sınırlı avtivite gösteridi. Ağırlıkça %0,5 tetrasiklin hidroklorür oranı için, inhibisyon bölgesi tespit edilmedi ve daha yüksek konsantrasyonlu numuneler düşük antibakteriyel aktivite gösterdi (~ 8-10 mm inhibisyon bölgesi). Literatürle uyumlu olarak, Gram negatif bakteri E. coli'nin tetrasiklin hidroklorür antibiyotiğine daha dirençli olduğu bulundu. Ek olarak, inhibisyon bölgeleri beklendiği gibi artan antibiyotik konsantrasyonu ile genişledi. Salım özellikleri ile elde edilen optimum antibiyotik oranı %0,5 olarak bulundu. %0,5 antibiyotik oranı, Gram pozitif bakteriler için yeterli etkinliğe sahiptir. Fakat geniş spektrumlu antibiyotik olarak kullanılmak istendiğinde, yüklü olan antibiyotik oranını arttırmak gerektiği sonucuna ulaşıldı. Bu çalışmada elektro-eğirme yöntemi ile nanolif eldesinde, doğal bir polimer olan jelatin kullanılarak, hücre uyumluluğunu arttırmak, enzimatik sentezlenmiş kopolimer kullanarak da mekanik özelliklerin arttırılması hedeflendi. Çeşitli kopolimer/jelatin oranları ve farklı çözücüler denenerek, optimum yapıdaki nanolif membran başarı ile elde edildi. Mekanik özellikleri daha da iyileştirmek için çapraz bağlanan numuneler ilaçsız olarak karakterize edildi ve bozunma özellikleri incelendi. Çalışmanın son basamağında, çeşitli oranlarda antibiyotik yüklenen membranların kontrollü salım özellikleri incelendi ve bakterilere karşı aktiviteleri ölçüldü. Öte yandan daha ileri bir çalışma olarak elde edilen membranlara sitotoksitite testleri çalışılabilir.